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293細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)基產(chǎn)品使用方法

產(chǎn)品描述

Balance CD 293 培養(yǎng)基適用于懸浮培養(yǎng)條件下的HEK293細(xì)胞（如293-F,293-T, Expi-293F

等）的高密度生長和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)。 Balance CD 293 培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長所需的全部營養(yǎng)成

份，無需添加任何添加物即可使用。（注意：此培養(yǎng)基不包含抗生素以及血清）

產(chǎn)品特點(diǎn)

?? 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基，適用于HEK293細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)

?? 無蛋白、無動(dòng)物源、化學(xué)成分限定

?? 即用型*培養(yǎng)基,無需添加額外成分

基礎(chǔ)參數(shù)

外觀：澄清透明紅色液體

滲透壓：275±15 mOSM

pH:6.9-7.4

無菌檢測(cè):無菌

內(nèi)毒素： <5 EU/mL

儲(chǔ)存條件：2-8℃，避光

效期：12個(gè)月

產(chǎn)品用途：僅用于科學(xué)研究，不適用于人類或動(dòng)物的診斷和治療

產(chǎn)品使用方法

細(xì)胞馴化

1）直接馴化

大部分情況下，培養(yǎng)于其他培養(yǎng)基中的細(xì)胞，可以直接適應(yīng)Balance CD 293 medium，只要

按照日常傳代方式（稀釋）更換培養(yǎng)基即可。

2）漸進(jìn)式馴化

注意：選用低代次、處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行馴化

①在原培養(yǎng)基中復(fù)蘇細(xì)胞并繼續(xù)使用該培養(yǎng)基傳代2到3次至細(xì)胞生長穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2x10⁶ cells/ml后進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞密度控制在0.5-0.6×10⁶ cells/mL，5-10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或其他無血清培養(yǎng)基與Balance CD 293培養(yǎng)基的比例為75:25；

②將細(xì)胞置于37℃，5% CO2，轉(zhuǎn)速為110-175 rpm的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)；

③當(dāng)細(xì)胞密度3-4天后達(dá)到3x106 cells/ml且細(xì)胞活率>90%，傳代時(shí)5-10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或其他無血清培養(yǎng)基與Balance CD 293培養(yǎng)基的比例為50:50，細(xì)胞密度控制在0.5×106 cells/mL。如細(xì)胞生長慢，可離心上清，留20%條件培養(yǎng)基，加入80%的5-10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或其他無血清培養(yǎng)基與Balance CD 293 培養(yǎng)基比例為75:25的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

④重復(fù)步驟③逐步增加Balance CD 293培養(yǎng)基所占的比例(5-10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或其他無血清培養(yǎng)基與Balance CD 293 培養(yǎng)基的比例為25:75至10:90）直到100%的Balance CD 293培養(yǎng)基；

⑤經(jīng)過在100%的 Balance CD 293 培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng)，傳代后3-4天細(xì)胞的密度可以達(dá)到2-3×106 cells/mL，細(xì)胞活率大于90%，這說明細(xì)胞已經(jīng)*適應(yīng)了Balance CD 293 培養(yǎng)基。之后進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的起始密度可以降到0.3×106 cells/mL，一般傳代2-3次后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

注意: 一般細(xì)胞馴化過程中，前三代細(xì)胞的狀態(tài)可能不是很好，但一般從第四代開始狀態(tài)會(huì)有改善

細(xì)胞傳代

1）取細(xì)胞培養(yǎng)樣品，人工或儀器測(cè)定細(xì)胞密度以及活率；

2）計(jì)算傳代所需的細(xì)胞用量，建議起始細(xì)胞密度為0.2-0.4×106 cells/mL。建議復(fù)蘇的細(xì)胞至少培養(yǎng)兩代后再用于其他用途。傳代培養(yǎng)體積建議為15-20 mL（100 mL的培養(yǎng)瓶）或50-60 mL（250 mL 的培養(yǎng)瓶）；

3）將細(xì)胞置于37℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110-175 rpm的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，3-4天傳代一次。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染在Balance CD 293培養(yǎng)基中，采用商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑（例如 Gibco 293Fectin™

ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit ）或 PEI 可以實(shí)現(xiàn)對(duì) HEK293 細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞復(fù)蘇

1）迅速取出凍存的細(xì)胞，在37℃水浴條件下進(jìn)行解凍（可以在水中輕輕晃動(dòng)，時(shí)間控制在60s以內(nèi)）；

2）輕輕地混勻細(xì)胞并將融化的細(xì)胞全部移至15mL無菌離心管中，逐滴加入10 mL預(yù)熱到37℃的培養(yǎng)基，離心換液（100 g，5 min）去除全部上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，使得細(xì)胞密度達(dá)

到0.4-0.6×106 cells/mL；

3）將細(xì)胞置于37℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110-175 rpm的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)；

4）2-4天后通過人工或儀器測(cè)定細(xì)胞的密度以及活率，如果細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106 cells/mL，活率達(dá)到85%以上則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

5）如果細(xì)胞密度低于1.0×106 cells/mL，則建議對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心（100 g，5 min），然后重懸于20-30 mL 的新鮮培養(yǎng)基中使得細(xì)胞密度為0.4-0.6×106 cells/mL 左右，并繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞正常生長則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存

1）凍存細(xì)胞時(shí)，要選擇處于對(duì)數(shù)生長期同時(shí)細(xì)胞活率在90%以上的 HEK293 cells ；

2）事先計(jì)算好凍存的細(xì)胞管數(shù)和所用的培養(yǎng)基的體積；

3）制備細(xì)胞凍存液：46.25% 的新鮮Balance CD 293培養(yǎng)基+46.25% 條件Balance CD 293 培養(yǎng)基，混合之后再加入7.5% DMSO，存放在4℃，一般為當(dāng)天用當(dāng)天制備；

4）對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)；

5）取樣計(jì)數(shù)，以100 g，3-5 min的條件離心收集細(xì)胞，然后用凍存培養(yǎng)基（ 4℃ ）重懸細(xì)胞，使得細(xì)胞密度為 5-10×106 cells/mL；

6）取樣計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度；迅速分裝細(xì)胞到無菌的凍存管中，一般2 mL 的凍存管放1-1.5 mL，貼好標(biāo)簽，密封；

7）將細(xì)胞凍存管放到程序降溫凍存盒（注意填充異丙醇，4℃預(yù)冷）中，置于-80℃ 冰箱(每分鐘下降1℃)，過夜存放后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中進(jìn)行保存。